α-Glucosidase-Hemmtest
An dieser Stelle
bestimmen die Forscher den Test für die a-Glucosidase-Hemmaktivität. Als Substrat wird ρ-Nitrophenyl-ρ-D-glucopyranosid (PNPG) verwendet. Die Algenextrakte werden vorbereitet, in einer 96-Well-Mikroplatte gemischt und 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. 75 μl PNPG werden in die Vertiefungen mit der Probe, dem Leersubstrat und den Negativ-/Positivkontrollen gegeben. Die verbleibenden Vertiefungen werden mit 75 μl 30 mM Phosphatpuffer gefüllt. Die Vertiefungen werden 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktionsmischungen werden mit einem Stoppmittel versetzt und die Absorption wird mit einem auf 405nm eingestellten Spektralphotometer gemessen. Die resultierende a-Glucosidase-Hemmaktivität wird als Prozentsatz (%) der Hemmung angegeben.
Zellen und Kulturbedingungen
Die folgenden Zellen werden verwendet:
- MCF-7-Zellen (humane Adenokarzinom-Zelllinie der Brust, Östrogenrezeptor-positiv)
- MDA-MB-231-Zellen (humane Brust-Adenokarzinom-Zelllinie, Östrogenrezeptor-negativ)
- HT-29-Zellen (humane kolorektale Adenokarzinom-Zelllinie)
- Hep G2-Zellen (menschliche Leberzellkarzinom-Zelllinie)
- 3T3-Zellen (embryonale Fibroblastenzellen der Maus)
Die Zellen wurden zu Forschungszwecken in RPMI-Medium gehalten, das mit 10 % fetalem Kälberserum (FCS), 100 Einheiten/ml Penicillin und 0,1 mg/ml Streptomycin angereichert ist.
MTT-Assay-Bedingungen
Die Probenextrakte werden auf ihren
Zytotoxizitätsgrad getestet. Die Extrakte werden an den oben erwähnten Zellen getestet. Das Protokoll, das bei der Untersuchung der
krebshemmenden Wirkung von Typhonium flagelliforme auf die menschliche T4-Lymphoblastoid-Zelllinie CEM-ss verwendet wird, dient zur Bestimmung der Zytotoxizität mittels MTT-Assay. Zu Beginn wurde die Zellkultur vorbereitet (in einer Konzentration von 1 × 105 Zellen/mL) und in 96-Well-Platten (100 μL/Well) plattiert. Dann erfolgt die Inkubation, die verdünnten Bereiche werden in Dimethylsulfoxid (DMSO) aufgelöst, wobei die Konzentration des DMSO 0,1 % (v/v) beträgt.
Die Konzentrationen werden in dreifacher Ausführung mit unbehandelten Zellkontrollen und einer leeren zellfreien Kontrolle in jedem Fall ausgetragen. Eine positive Kontrolle wurde ebenfalls beibehalten. Nach einer 68-stündigen Inkubationszeit wurden 20 μl MTT (5 mg/mL) in die einzelnen Vertiefungen gegeben, um die Bildung von
Formazankristallen zu ermöglichen, und anschließend bebrütet, um das Medium später zu entfernen.
Die Absorption wurde aufgezeichnet, der Prozentsatz der zellulären Lebensfähigkeit wurde notiert, die Konzentration, die 50 % des Zellwachstums hemmte (IC50-Wert), wurde gemessen, die hemmende Rate der Zellproliferation wurde berechnet, die Zytotoxizität der Probe auf Krebszellen wurde als IC50-Werte ausgedrückt, und außerdem ergaben die Tests auf Mykoplasmenkontamination bei diesen Proben einen negativen Befund.
Gaschromatographie-Massenspektrometrie-Analyse
Dieser Teil des Experiments dient
der Charakterisierung und Quantifizierung der bioaktiven Substanzen in den Algenextrakten. Für die Studie wurde die Methode aus der
Forschung über die Triterpenglykoside der Seegurke Holothuria leucospilota verwendet, natürlich mit Modifikationen.
